|
Стр. 3
J1
lg ---- = D = kb"ДЕЛЬТА"с. (12)
J2
Относительная пропускаемость определяется разницей в
концентрациях вещества в анализируемых растворах ("ДЕЛЬТА"с).
Выбор оптимальных условий анализа проводится различными
способами: наиболее простой из них - предварительное построение
серии калибровочных графиков. Концентрации препаратов в растворах
сравнения подбирают таким образом, чтобы оптическая плотность
отличалась на 0,2 - 0,4. На каждом из построенных графиков
устанавливают величину относительной погрешности, используя
анализируемые растворы с относительной оптической плотностью 0,4 -
0,5. Оптимальными считают те концентрации раствора сравнения и
анализируемого раствора, с помощью которых достигнута наименьшая
относительная ошибка определений.
Для анализа готовят раствор сравнения с известным количеством
испытуемого вещества и при помощи двух кювет, заполненных
раствором сравнения, устанавливают на нуль шкалу оптической
плотности прибора. Затем одну из кювет заполняют анализируемым
раствором и измеряют оптическую плотность по отношению к раствору
сравнения.
Интенсивность светового потока на спектрофотометре регулируют
только шириной щели, а на фотоколориметре - световым клином.
Концентрацию анализируемого вещества находят либо по
калибровочному графику, либо расчетным путем с помощью фактора
пересчета F по формуле:
_
с = с + D F, (13)
х 0 x
где с - концентрация вещества в растворе сравнения; D -
0 _ x
относительная оптическая плотность анализируемого раствора; F -
среднее значение фактора F, рассчитанного из нескольких
стандартных растворов и представляющего собой отношение разности
концентраций двух стандартных растворов к величине относительной
оптической плотности.
ЭМИССИОННАЯ И АТОМНО - АБСОРБЦИОННАЯ
ПЛАМЕННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ
Эмиссионная и атомно - абсорбционная пламенная спектрометрия
применяется для качественного и количественного определения
химических элементов в различных объектах: лекарственных
средствах, реактивах, воде, биологических жидкостях и др.
В основе эмиссионной пламенной спектрометрии лежит
использование спектров испускания возбужденных атомов или молекул
определяемых элементов. При создании атомного облака в пламени
некоторые атомы возбуждаются и переходят на более высокие
энергетические уровни. Когда эти атомы возвращаются на нижние
(основные) энергетические уровни, то энергия, полученная атомами,
испускается (спектр испускания).
Принцип эмиссионной пламенной спектрометрии заключается в
следующем: анализируемый раствор распыляется в виде аэрозоля в
пламени горелки, работающей на горючем газе. При воздействии
температуры пламени происходит ряд сложных физических и химических
процессов: испарение растворителя из капель аэрозоля, испарение
твердых частиц, диссоциация молекул, возбуждение атомов и
возникновение характеристического излучения атомов.
Излучение определяемого элемента отделяется от постороннего с
помощью светофильтра или монохроматора, попадает на фотоэлемент и
вызывает фототок, который измеряется с помощью гальванометра,
электронного потенциометра и других приборов. Количественное
определение элемента по методу эмиссионной пламенной спектрометрии
основано на функциональной зависимости интенсивности спектральной
линии (I) и концентрации элемента в растворе (с). Прямая
пропорциональность между I и "с" имеет место лишь в определенной
для данного элемента области концентрации. При этом линейную
зависимость I от "с" может нарушать самопоглощение, ионизация,
образование газообразных или трудно диссоциирующих в пламени
соединений.
Принцип атомно - абсорбционной спектрометрии заключается в
следующем: резонансное излучение от лампы с полым катодом проходит
через пламя, в которое распыляется анализируемый раствор пробы.
Излучение попадает на входную щель монохроматора, установленного
таким образом, что выделяется из спектра только резонансная линия
определяемого элемента, интенсивность которой измеряется
фотоэлектрическим способом. Измеряют уменьшение интенсивности
резонансной линии вследствие поглощения ее атомами определяемого
элемента, принимая интенсивность ослабленной линии за 100%.
Величина поглощения резонансного излучения пропорциональна числу
атомов, находящихся в поглощающем слое. Зависимость между
ослаблением интенсивности излучения источника света (I) и
концентрацией вещества (с) может быть выражена уравнением:
-kcl
I = I0l ,
где I0 - интенсивность резонансного излучения; I -
интенсивность излучения, прошедшего поглощающий слой; k -
коэффициент поглощения света в центре линии поглощения; с -
концентрация поглощающего компонента; l - толщина поглощающего
слоя.
Погрешность определения элемента в методе атомно -
абсорбционной пламенной спектрометрии могут вызывать: ионизация
исследуемых атомов при температуре пламени, образование стойких
химических соединений в пламени, неселективное поглощение света и
другие факторы.
Число возбужденных атомов увеличивается с ростом температуры,
которая зависит в основном от теплотворной способности создающего
пламя газа. В используемых фотометрических методах применяется в
основном пламя следующих газовых смесей.
Состав газовой смеси Температура, град. С
Светильный газ + воздух 1840
Ацетилен + воздух 2250
Ацетилен + кислород 3050
Водород + кислород 2680
Ацетилен + закись азота 2955
Чувствительность определения может быть повышена при применении
более горячего пламени или других более эффективных способов
атомизации проб, например использование графитовой кюветы, лазеров
и т. д.
Измерение интенсивности излучения спектральных линий
определяемых элементов можно проводить на отечественных пламенных
фотометрах, например типа ПФЛ-1, ПФМ, ПАЖ-1 или Flapho-4 (ГДР) и
др., а поглощение резонансных линий - на атомно - абсорбционных
спектрофотометрах, например типа "Спектр-1" и "Сатурн" (СССР), AAS-
1 (ГДР) и др. В качестве регистрирующих систем могут
использоваться вольтметры и потенциометры, снабженные цифровыми
или печатающими устройствами. Точность методов пламенной
фотометрии и атомной абсорбции в зависимости от концентрации
вещества составляет 1-4%; чувствительность определяется свойствами
аналитической линии, составом пробы, классом аппаратуры и может
достигать 0,001 мкг/мл.
Для определения концентрации вещества в анализируемых объектах
используются в основном следующие методы: градуировочной кривой,
стандартных добавок, сравнения и ограничивающих растворов.
Реактивы и эталонные растворы. Вода должна быть
деионизированной на ионообменных смолах и продистиллированной
непосредственно перед употреблением.
Ниже приведены растворы солей, катионы которых обозначены
названиями элементов.
Кальций. 1,001 г кальция карбоната, высушенного до постоянной
массы при температуре 105 град. С, растворяют в 25 мл
хлористоводородной кислоты (1 моль/л) и доводят объем раствора
водой до 1000 мл. Раствор кальция содержит 400 мкг ионов Са в 1
мл.
Срок годности раствора 1 мес, хранение при комнатной
температуре.
Калий. 1,1440 г калия хлорида, высушенного до постоянной массы
при температуре 130 град. С, растворяют в небольшом количестве
воды и доводят объем раствора водой до 1000 мл. Раствор калия
содержит 600 мкг ионов К в 1 мл.
Срок годности раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Натрий. 0,5084 г натрия хлорида, высушенного до постоянной
массы при температуре 130 град. С, растворяют в небольшом
количестве воды и доводят объем раствора водой до 1000 мл. Раствор
натрия содержит 200 мкг ионов Na в 1 мл.
Срок годности раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Цинк. 2,5 г гранулированного цинка растворяют в 20 мл
хлористоводородной кислоты (5 моль/л) и доводят объем раствора
водой до 500 мл. Раствор цинка содержит 5 мг ионов Zn в 1 мл.
Срок годности раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Свинец. 0,1600 г свинца нитрата растворяют в 5 мл азотной
кислоты и доводят объем раствора водой до 1000 мл. Раствор свинца
содержит 100 мг ионов Рb в 1 мл.
Срок годности раствора 1 мес, хранение при комнатной
температуре.
Медь. 1,000 г меди электролитической растворяют в небольшом
объеме 50% азотной кислоты и доводят объем раствора 1% азотной
кислотой до 1000 мл. Раствор меди содержит 1 мг ионов Cu в 1 мл.
Срок годности раствора 1 мес, хранение при комнатной
температуре.
При составлении эталонного раствора расчет количества
соединения химического элемента (X) в граммах проводят по
уравнению:
М
Х = аb ----,
nА
где а - масса (в граммах) вводимого в раствор элемента на 1 г
готового эталонного раствора; b - масса готового эталонного
раствора в граммах; М - молекулярная масса соединения, в которое
входит вводимый в эталонный раствор элемент; n - число атомов
вводимого элемента в используемом для приготовления эталонного
раствора соединении; А - атомная масса вводимого в эталонный
раствор элемента.
Эталонные, а также приготовленные на их основе рабочие растворы
хранят в посуде из плавленого кварца, из чистого полиэтилена ГОСТ
16337-77 Е или из тефлона. Чашки и тигли для озоления проб должны
быть изготовлены из кварца.
ФЛУОРИМЕТРИЯ
Флуориметрия - метод фотометрического анализа, основанный на
измерении интенсивности флюоресценции испытуемых веществ.
Интенсивность флюоресценции в разбавленных растворах может быть
определена следующим уравнением:
F = J02,3"эпсилон"сb"фи",
где F - общая интенсивность флюоресценции, квант/с; J0 -
интенсивность возбуждающего света, квант/с; с - концентрация
раствора, моль/л; "эпсилон" - молярный коэффициент поглощения; b -
толщина флюоресцирующего слоя, см; "фи" - квантовый выход
флюоресценции, зависящий от природы вещества.
Это уравнение может быть использовано для растворов с
оптической плотностью D, не превышающей 0,05 при длине волны
возбуждения (при D = 0,05 ошибка в определении интенсивности
флюоресценции составляет около 5%; влияние эффекта внутреннего
фильтра).
Практически флюоресценцию определяют в растворах с
-5 -6
концентрацией 10 - 10 моль/л и меньше, когда между
интенсивностью флюоресценции и концентрацией вещества наблюдается
прямолинейная зависимость: при более высоких концентрациях
линейность нарушается, а затем наблюдается концентрационное
тушение флюоресценции.
Интенсивность флюоресценции в значительной степени зависит от
длины волны возбуждающего света, величины рН испытуемого раствора,
характера растворителей и присутствия в растворе посторонних
веществ, поглощающих некоторую долю возбуждающей энергии
(экранирующий эффект) или дезактивирующих возбужденные молекулы.
Так, прибавление хлорида натрия снижает выход флюоресценции
хинина, прибавление веществ с фенольными или гидроксильными
группами тушит флюоресценцию рибофлавина, прибавление
хлористоводородной кислоты тушит флюоресценцию тиохрома,
прибавление едкого натра тушит флюоресценцию птеринов и т. д.
Во флюоресцентных исследованиях часто важно регулирование
температуры и удаление кислорода, являющегося сильным тушителем
флюоресценции. При одновременном определении испытуемого и
стандартного образцов необходимость термостатирования и удаления
кислорода, как правило, отпадает, для этого измерение надо
проводить достаточно быстро, чтобы не произошло нагревания образца
от источника облучения.
Спектр флюоресценции находится по сравнению со спектром
поглощения в более длинноволновой области (на 50 - 100 нм) и дает
широкие полосы излучения в пределах от 100 до 200 нм.
Характер спектра флюоресценции, а также цвет излучаемого света
специфичны для флюоресцирующих веществ (флуорохромов), поэтому
флюоресценция может быть применена как для качественного, так и
для количественного анализа.
Для выполнения флуориметрического анализа используют
спектрофлуориметры, принцип работы которых заключается в
следующем: свет от ртутно - кварцевой лампы через первичный
светофильтр и конденсор падает на кювету с раствором испытуемого
вещества; последнее начинает флюоресцировать. Кванты возбужденного
света проходят через вторичные светофильтры и падают на
фотоэлемент, соединенный с чувствительным гальванометром,
отмечающим количество поступающего на фотоэлемент света.
Для проведения количественного анализа в качестве раствора
сравнения применяют раствор стандартного образца флюоресцирующего
вещества известной концентрации. Расчет производят по формуле:
(n1 - n2)c
Х = -----------,
n - n2
где n1-n2 - показания спектрофлуориметра для испытуемого
раствора за вычетом поправки на контрольный опыт; n - n2 - то же
для раствора стандартного образца за вычетом поправки на
контрольный опыт; с - концентрация раствора стандартного образца в
выбранных единицах измерения.
Расчет производят с помощью калибровочного графика или шкалы
стандартных растворов.
Так как интенсивность флюоресценции пропорциональна
концентрации вещества обычно в очень узкой области, соотношение
- Jх - J0 ¬
¦---------¦ (Jх, J0, Jс - соответственно интенсивности
L Jс - J0 -
флюоресценции испытуемого раствора, растворителя и стандартного
раствора) должно быть не менее 0,40 и не более 2,50.
Относительная ошибка флуориметрического метода составляет не
более 5%.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ БЕЛИЗНЫ
ПОРОШКООБРАЗНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
В случае твердых субстанций оценка степени белизны (оттенка)
может быть проведена инструментальным методом, исходя из
спектральной характеристики света, отраженного от образца. В
простейшем случае оценку степени белизны можно получить, исходя из
коэффициентов отражения, измеренных при освещении образца белым
светом (источник со спектральным распределением, соответствующим
спектральному распределению источника типа А по ГОСТу 7721-76), а
также белым светом, пропущенным через красный или синий фильтр с
эффективными максимумами пропускания соответственно при 614 и 459
нм. Коэффициент отражения белого света (rб) при оценке степени
белизны может быть заменен коэффициентом отражения света,
пропущенного через зеленый светофильтр с максимумом пропускания
при 522 нм.
Коэффициент отражения представляет собой отношение величины
отраженного светового потока к величине падающего светового
потока.
Измерение коэффициентов отражения осуществляют на приборах
типа лейкометра или спектрального фотометра "Specol-10" (фирмы
"Carl Zeiss Jena", ГДР). Измеренные относительно эталона с
коэффициентом отражения в видимой области спектра ~=0,85, значения
коэффициентов отражения образцов лекарственного вещества (r)
позволяют определить наличие или отсутствие у них цветового или
сероватого оттенка соответственно по величинам степени белизны
("альфа") и степени яркости ("бета"). Величину степени белизны
"альфа" определяют для лекарственных веществ с желтоватым,
r459
кремоватым или розоватым оттенками как отношение ----, а для
r614 r614
лекарственных веществ с голубоватым оттенком - как отношение ----.
r459
Степень яркости "бета" характеризуют величиной r522 или rб. (В
индексах r указана длина волны максимума пропускания
светофильтров).
Для белых и белых с сероватым оттенком лекарственных веществ
величина "альфа" теоретически равна 1. Если "альфа" < 1, то
лекарственное вещество имеет оттенок. Лекарственные вещества, для
которых "бета" < 0,85 и "альфа" находится в интервале 0,95-1,00,
имеют сероватый оттенок.
Уточненная оценка белизны лекарственных веществ с указанием
интенсивности цветовых и сероватого оттенков может быть проведена
с использованием абсолютных коэффициентов отражения (R),
определяемых с помощью спектрофотометров отражения, снабженных
интегрирующей сферой, например СФ-18 ("ЛОМО", СССР). Настройка
прибора в этом случае осуществляется по эталону с коэффициентом
отражения в видимой области ~= 1.
При этом интенсивность цветового и сероватого оттенков
оценивают по величинам степени белизны (альфа') и степени яркости
(бета') соответственно. Величину степени белизны альфа' определяют
для лекарственных веществ с желтоватым, кремоватым и розоватым
R459
оттенками как отношение ------, а для лекарственных веществ c
R614
R614
голубоватым оттенком - как отношение ----. Степень яркости
R459
(бета') характеризуют величиной максимального коэффициента
отражения образца лекарственного вещества в видимой области Rmax.
Оценка интенсивности цветового и сероватого оттенков
проводится в соответствии с табл. 1 и 2.
Таблица 1
Оценка интенсивности цветового оттенка
по величине степени белизны альфа'
----T----------------T-------------------------------------------¬
¦ N ¦Пределы значений¦ Оценка интенсивности цветового оттенка ¦
¦п/п¦ альфа' ¦ ¦
+---+----------------+-------------------------------------------+
¦ 1 ¦ 1,00 - 0,96 ¦ Отсутствует оттенок ¦
¦ 2 ¦ 0,96 - 0,94 ¦ Едва заметный оттенок ¦
¦ 3 ¦ 0,94 - 0,90 ¦ Слабый оттенок ¦
¦ 4 ¦ 0,90 - 0,86 ¦ Отчетливый оттенок ¦
L---+----------------+--------------------------------------------
Примечание. При величине (альфа') < 0,86 лекарственное вещество
не следует рассматривать как имеющее белый цвет.
Значения степени белизны ("альфа" и альфа') и степени яркости
("бета" и бета') являются объективными характеристиками качества
белых и белых с оттенками лекарственных веществ. Пределы их
допустимых значений могут быть регламентированы в частных статьях.
Методика определения. Подготовка пробы. В зависимости от
поставленной задачи определение степени белизны и степени яркости
может производиться на образцах порошкообразных лекарственных
веществ без предварительной обработки или после их измельчения в
течение 2 мин на лабораторной электрической мельнице ЭМ-3А (ГОСТ
5.692-70). Масса пробы, необходимая для проведения измерений,
составляет 2-3 г.
Таблица 2
Оценка интенсивности сероватого оттенка
по величине степени яркости бета'
----T--------------------T---------------------------------------¬
¦ N ¦ Пределы значений ¦ Оценка интенсивности ¦
¦п/п¦ бета' ¦ сероватого оттенка ¦
+---+--------------------+---------------------------------------+
¦ 1 ¦ 1,00 - 0,98 ¦ Отсутствие оттенка ¦
¦ 2 ¦ 0,98 - 0,97 ¦ Едва заметный оттенок ¦
¦ 3 ¦ 0,97 - 0,95 ¦ Слабый оттенок ¦
¦ 4 ¦ 0,95 - 0,92 ¦ Отчетливый оттенок ¦
L---+--------------------+----------------------------------------
Примечание. При величине (бета') < 0,92 лекарственное вещество
не следует рассматривать как имеющее белый цвет.
Порошок лекарственного вещества помещают в кювету и легкими
ударами по дну последней уплотняют пробу. После этого стеклянным
матированным плоским пестиком прижимают поверхность порошка,
избегая горизонтальных перемещений пестика относительно
поверхности пробы. Затем при необходимости кювету накрывают
бесцветным плоским стеклом (лучше кварцевым).
Измерение на приборах типа лейкометра. Измерение коэффициентов
отражения проб проводят в соответствии с инструкцией по
пользованию прибором при белом свете (без светофильтра) и при
красном, синем и зеленом светофильтрах или настройке монохроматора
соответственно на длины волн 614, 459 и 522 нм. Перед каждым
измерением прибор настраивают по эталону, имеющему коэффициенты
отражения в видимой области ~= 0,85. Каждое измерение повторяют не
менее 2 раз.
Результаты измерений коэффициентов отражения представляют в
_
виде среднего арифметического rх и вычисляют значение "альфа".
Принимают "бета" = rб или "бета" = r522.
--------------T-----------------------------------T-------T------¬
¦ ¦ Показания лейкометра ¦ ¦ ¦
¦Лекарственное+-----T-----T-----T-----T-----T-----+"альфа"¦"бета"¦
¦ вещество ¦ ¦ _ ¦ ¦_ ¦ ¦_ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ rб ¦ rб ¦r459 ¦r459 ¦r614 ¦r614 ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-------+------+
¦ ¦92,10¦ ¦91,49¦ ¦92,87¦ ¦ ¦ ¦
¦ Этазол ¦92,35¦92,20¦91,28¦91,39¦93,11¦92,97¦ 0,98 ¦ 0,92 ¦
¦ ¦92,15¦ ¦91,43¦ ¦92,93¦ ¦ ¦ ¦
L-------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-------+-------
Поскольку "альфа" < 1, a "бета" > 0,85, этазол имеет цветовой
оттенок и не имеет сероватого оттенка.
Измерение на спектрофотометре с интегрирующей сферой. Измерение
коэффициентов отражения проводят в соответствии с инструкцией по
пользованию спектрофотометром, в следующем порядке. В правую и
левую кюветы помещают эталон белизны бария сульфат квалификации
"для отражательной спектрофотометрии" и настраивают прибор.
Регистрируют спектр отражения исследуемого лекарственного
вещества. Исходя из полученной спектрограммы определяют значения
R459, R614 и Rmax.
Каждое измерение повторяют не менее 2 раз. Результаты
измерений коэффициентов отражения представляют в виде средних
_ _ _
арифметических R459, R614, Rmax. По получении указанных
коэффициентов отражения рассчитывают значение (альфа'); величину
_
бета' принимают равной Rmax.
Пример:
--------------T-----------------------------------T------T-------¬
¦ ¦ Показания спектрофотометра ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Лекарственное+-----T-----T-----T-----T-----T-----+альфа'¦ бета' ¦
¦ вещество ¦ ¦_ ¦ ¦_ ¦ ¦_ ¦ ¦ ¦
¦ ¦R459 ¦R459 ¦R614 ¦R614 ¦Rmax ¦Rmax ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------+-------+
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦0,802¦ ¦0,853¦ ¦0,980¦ ¦ ¦ ¦
¦Этазол ¦ ¦0,800¦ ¦0,853¦ ¦0,980¦ 0,93 ¦ 0,98 ¦
¦ ¦0,798¦ ¦0,853¦ ¦0,980¦ ¦ ¦ ¦
L-------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------+--------
Найденное значение (альфа') находится в пределах 0,94 - 0,90,
следовательно, образец имеет слабый цветовой оттенок (см. табл.
1). Найденное значение (бета') составляет 0,98, следовательно, у
образца отсутствует сероватый оттенок (см. табл. 2).
СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР -
спектроскопия) - физический метод, основанный на регистрации
индуцированных радиочастотным полем переходов между ядерными
магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, помещенного
в постоянное магнитное поле. Переходы между ядерными магнитными
уровнями возможны для ядер, обладающих магнитным моментом, т.е.
имеющих спиновое квантовое число 1, не равное нулю. Такими
1 13 19 31
свойствами обладают ядра Н, С, F, P, у которых 1 = 1/2, и
др. Совокупность сигналов переходов между энергетическими уровнями
ядер молекул составляет спектр ЯМР. Каждый отдельный спектр ЯМР
регистрируется для одного типа ядер. Спектр ЯМР специфичен для
каждого вещества. Наибольшее распространение в исследовании
органических лекарственных веществ имеет спектроскопия протонного
13
магнитного резонанса (ПМР) и ЯМР С.
Основные характеристики спектра ЯМР
Основными характеристиками спектров ЯМР являются химический
сдвиг, мультиплетность, константа спин - спинового взаимодействия
и площадь сигнала резонанса. Эти характеристики зависят от
химического окружения данного ядра или группы ядер, от числа
соседних ядер, обладающих магнитным моментом, от их относительного
расположения, а также от числа анализируемых ядер в различных
структурных фрагментах молекулы.
Химический сдвиг ("дельта") определяет положение сигнала
резонанса в спектре ЯМР и зависит от химического окружения данного
ядра или группы ядер. Химический сдвиг выражается в миллионных
долях (м.д.) и измеряется относительно сигнала резонанса
эталонного соединения (эталона измерения химического сдвига),
добавляемого к анализируемым растворам (менее 1%). Для растворов в
органических растворителях в качестве эталона используют
1 13
тетраметилсилан (ТМС), химические сдвиги сигналов ЯМР Н и С
1 13
которого приняты за начало отсчета, "дельта " ( Н, С) = 0,00
ТМС
("дельта" - шкала химических сдвигов). Для водных растворов в
1
качестве эталона измерения химических сдвигов ЯМР Н используют
2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия (ДСС) с химическим
1
сдвигом метильных протонов "дельта " ( Н) = 0,015, а для
ДСС
13 13
измерения сдвигов ЯМР С - диоксан (ДО), "дельта " ( С) = 67,4.
ДО
Химические сдвиги могут быть измерены относительно сигналов
резонанса других эталонов и пересчитаны в "дельта" - шкалу по
формуле:
"дельта" = "дельта " + "дельта ",
х ст
где "дельта" - химический сдвиг сигнала анализируемого
вещества в "дельта" - шкале; "дельта " - химический сдвиг сигнала
х
анализируемого вещества относительно сигнала используемого эталона
X; "дельта " - химический сдвиг сигнала эталона в "дельта" -
ст
шкале.
Для большинства органических веществ сигналы ПМР регистрируются
в диапазоне от "дельта" = 0,0 до "дельта" = 14,0. Значения
химических сдвигов отсчитывают по оси абсцисс спектра справа
налево.
Мультиплетность сигнала резонанса (М) определяется числом
компонент сверхтонкой структуры сигнала, на которые он
расщепляется под влиянием соседних ядер, обладающих спиновым
квантовым числом 1, не равным нулю. Мультиплетность сигнала ПМР
(для протона 1 = 1/2) в спектрах первого порядка определяется по
формуле:
M = n + 1,
где n - число протонов в соседней группе.
Спектрами первого порядка являются спектры, в которых разность
химических сдвигов мультиплетных сигналов резонанса
взаимодействующих ядер, выраженная в герцах, значительно превышает
константу спин - спинового взаимодействия ("ДЕЛЬТАдельта" "ни" / J
> 10, где "ДЕЛЬТАдельта" - разность химических сдвигов, м.д.; "ни"
- рабочая частота спектрометра, МГц; J - константа спин -
спинового взаимодействия в герцах) и каждая из групп ядер магнитно
эквивалентна.
В случае магнитной неэквивалентности ядер соседних групп
n
мультиплетность сигнала определяется по формуле М = 2 .
В спектрах высших порядков, для которых разность химических
сдвигов сигналов взаимодействующих ядер незначительно превышает
константу спин - спинового взаимодействия, определение
мультиплетности в ряде случаев затруднено. Интенсивности компонент
в мультиплетах спектров первого порядка пропорциональны
биномиальным коэффициентам. Для дублетных сигналов отношение
интенсивностей компонент составляет 1:1, для триплетных - 1:2:1,
для квартетных 1:3:3:1 и т. д. В близко расположенных мультиплетах
взаимодействующих ядер, когда разность химических сдвигов
незначительно превышает константу спин - спинового взаимодействия,
наблюдается отклонение от указанной пропорциональности. Это
проявляется в увеличении интенсивности компонент, ближайших к
соседнему мультиплету, за счет уменьшения интенсивности более
удаленных компонент.
Константа спин - спинового взаимодействия (J) выражается в
герцах и определяется расстоянием между компонентами мультиплетов
спектров первого порядка. В спектрах высших порядков определение
констант спин - спинового взаимодействия в ряде случаев затруднено
и требует привлечения специальных расчетов с использованием ЭВМ.
Значения констант спин - спинового взаимодействия зависят в
основном от электроотрицательности заместителей и взаимного
пространственного расположения групп взаимодействующих ядер, в
частности от числа химических связей, отделяющих эти ядра, и от
углов между химическими связями. Для большинства органических
веществ константы протон - протонного спин - спинового
взаимодействия имеют значения от 0 до 16 Гц.
Площадь сигнала резонанса (S) спектра ЯМР пропорциональна числу
ядер, обусловливающих данный сигнал. Площади сигналов спектров ПМР
используют для определения числа протонов в соответствующих
группах молекул для измерения концентраций анализируемых
соединений или примесей.
Приборы и методы эксперимента
Спектры ЯМР высокого разрешения регистрируют для легкоподвижных
жидкостей или растворов твердых веществ в определенных
растворителях. Выбор растворителя определяется растворимостью
анализируемого вещества и наиболее полным разделением сигналов
резонанса вещества и растворителя, если последний содержит ядра,
по которым проводится регистрация спектра ЯМР. Для уменьшения
интенсивности сигналов растворителей в спектрах ПМР используют
дейтерированные, или апротонные, растворители. Химические сдвиги
сигналов остаточных протонов используемых дейтерированных
растворителей: хлороформ - d1 ("дельта" = 7,26), бензол
-- d6 ("дельта" = 7,16), вода - d2 ("дельта" = 4,7 <*>),
метанол - d4 ("дельта" = 3,35; 4,8 <*>), диметилсульфоксид - d6
("дельта" = 2,50; 3,7 <**>), уксусная кислота - d4 ("дельта" =
2,05; 8,5 <*>), ацетон - d6 ("дельта" = 2,05).
--------------------------------
<*> Химический сдвиг зависит от рН и температуры раствора.
<**> Сигнал протонов примеси воды.
Для регистрации спектров ПМР используют спектрометры с рабочими
частотами 60 МГц и более. Спектрометр ЯМР состоит из следующих
основных функциональных узлов: магнита с системой стабилизации и
коррекции магнитного поля, которые обеспечивают заданное значение
напряженности и высокой однородности постоянного магнитного поля в
объеме анализируемого образца, системы генерации радиочастотного
электромагнитного облучения образца и системы регистрации спектра.
Перед проведением анализов необходим контроль чувствительности,
разрешающей способности и стабильности работы прибора,
соответствия этих параметров требованиям, оговоренным в
технической документации. Раствор анализируемого вещества готовят,
как указано в частной статье. Раствор переносят в спектральную
ампулу и проводят регистрацию заданной области спектра на бланке.
Усиление подбирают таким, чтобы высота наиболее интенсивного
сигнала анализируемого вещества почти достигала верхнего края
диаграммного бланка, т.е. составляла около 90% по высоте.
Области применения
1 13
Спектры ЯМР Н и С представляют обширную информацию о
молекулярной структуре анализируемого вещества. Положение сигналов
резонанса в спектре, их тонкая структура и площади позволяют
определять число атомов водорода и углерода в отдельных группах,
ближайшее химическое окружение, сочленение отдельных структурных
фрагментов молекулы, наличие примесей.
Многообразие структурной информации спектров ПМР практически
исключает совпадение спектров разных соединений. В связи с этим
метод спектроскопии ЯМР применяется для идентификации
лекарственных веществ. Для этого используют наиболее полный набор
спектральных параметров, характеризующих структуру вещества. Если
вследствие сложности спектра ЯМР его полная интерпретация
затруднена, ограничиваются лишь характерными сигналами спектра
анализируемого вещества, по которым и судят о структуре данного
соединения или о наличии возможной примеси. В отдельных случаях
для подтверждения подлинности лекарственного вещества (примеси) к
анализируемому раствору после первичной регистрации спектра
добавляют определенное количество стандартного образца
исследуемого вещества (примеси) и проводят повторную запись
спектра в аналогичных условиях. Полное совпадение спектров
указывает на идентичность анализируемого вещества и стандартного
образца.
Спектры ЯМР могут быть использованы для количественного
определения относительного или абсолютного содержания
лекарственного вещества (примеси) в анализируемом лекарственном
средстве. При определении относительного содержания вещества
(примеси) измеряют площади сигналов резонанса анализируемого
вещества (примеси) и вещества, по отношению к которому проводится
количественное определение. Относительное мольное процентное (А)
или относительное весовое процентное (Б) содержание отдельных
веществ (примеси) в анализируемых лекарственных средствах
вычисляют по формулам:
100Si/ni
А = ---------------,
i=k
SUM (Si/ni)
i=1
100SiMi/ni
Б = ---------------,
i=k
SUM (Si/ni)
i=1
где Si - площади сигналов резонанса веществ (примеси); i, ni -
число ядер в структурных фрагментах молекул веществ (примеси),
которые обусловливают сигналы резонанса с площадями Si; Mi -
молекулярные массы вещества (примеси) i.
Для определения абсолютного содержания лекарственного вещества
(примеси) анализируемые образцы готовят количественно. К навеске
анализируемого вещества добавляют точно взвешенное количество
вещества, играющего роль внутреннего стандарта количественных
измерений. Дальнейшая процедура приготовления анализируемого
раствора и регистрация спектра проводится, как было описано выше.
По спектру измеряют площади сигналов анализируемого соединения
(примеси) и стандарта. Абсолютное процентное весовое содержание
вещества (примеси) в лекарственном средстве вычисляют по формуле:
В = 100 (Sа/Sст) (Ма nст mст/Мст nа mа),
где Sа/Sст - отношение площадей сигналов анализируемого
вещества (примеси) и стандарта; М - молекулярные массы; n - число
ядер в структурных фрагментах молекул веществ, обусловливающих
сигналы резонанса с соответствующими площадями; m - навески
анализируемого вещества и стандарта.
Эталон количественных измерений должен удовлетворять следующим
требованиям: растворяться в используемом растворителе при
концентрациях, соответствующих приблизительному равенству площадей
сигналов Sа и Sст; не взаимодействовать с растворителем и
анализируемым веществом; иметь постоянный состав, описываемый
химической формулой. Сигнал резонанса стандарта количественных
измерений должен регистрироваться в виде пика, не перекрывающегося
другими сигналами. Значения химических сдвигов характерных
сигналов веществ, используемых в качестве стандартов
количественных измерений по спектрам ПМР: малеиновая кислота (2СН,
"дельта" = 6,60), бензилбензоат (СН2, "дельта" = 5,30), малоновая
кислота (СН2, "дельта" = 3,30), сукцинимид (2СН2, "дельта" =
2,77), ацетанилид (СН3, "дельта" = 2,12), трет - бутанол (3СН3,
"дельта" = 1,30), гексаметилциклотрисилоксан (6СН3, "дельта" =
0,15). Относительная точность количественных измерений методом ЯМР
в основном определяется точностью измерений отношения площадей
резонансных сигналов и в общем случае составляет +/- (2 - 5%).
РАДИОАКТИВНОСТЬ
Радиоактивные препараты применяются при лечении и диагностике
различных заболеваний. Они требуют особой техники в обращении и в
работе для того, чтобы получить правильные результаты и снизить до
минимума опасность для персонала и пациента. Все операции должны
выполняться в соответствии с действующими санитарными правилами
работы с радиоактивными веществами и источниками ионизирующих
излучений и нормами радиационной безопасности персоналом,
специально обученным работе с радиоактивными препаратами.
Радиоактивные, в том числе радиофармацевтические, препараты
(РФП) предоставляются для использования учреждениям, располагающим
необходимыми условиями для правильной и безопасной работы с ними,
с разрешения органов саннадзора и органов внутренних дел.
Термины и определения
Радиоактивность - свойство некоторых нуклидов испускать
ионизирующее излучение при спонтанных ядерных превращениях.
Нуклид - вид атомов с данными числами протонов и нейтронов в
ядре (и, следовательно, характеризуется его атомным номером и
массовым числом).
Радионуклид - нуклид, обладающий радиоактивностью.
Изотопы - нуклиды с одинаковым числом протонов, свойственным
данному элементу, но отличающиеся числом нейтронов в их ядре.
Радиоизотопы - изотопы, обладающие радиоактивностью.
Ядерный изомер - нуклид, ядро которого находится в определенном
(возбужденном) энергетическом состоянии, отличном от основного.
Такое состояние с относительно продолжительным временем жизни
называют метастабильным.
Ядерными изомерами, широко используемыми в радиофармацевтике,
99m 113m
являются, например, Tc, In.
Активность радионуклида в препарате (образце) - отношение числа
dN спонтанных превращений из определенного ядерно -
энергетического состояния радионуклида, происходящих в данном
препарате (образце) за интервал времени dt, к этому интервалу
dN
А = ----. (1)
dt
Удельная активность (Am) - отношение активности радионуклида в
препарате (образце) к массе препарата (образца) или к массе
элемента (соединения).
Молярная активность (Amol) - отношение активности радионуклида
в препарате (образце) к количеству содержащегося в нем
радиоактивного вещества (соединения), выраженному в молях.
Объемная активность (Аv) - отношение активности радионуклида в
препарате (образце) к объему препарата (образца).
Период полураспада. Периодом полураспада, обозначаемым Т1/2,
называют время, в течение которого активность радионуклида
уменьшается в 2 раза.
Постоянная радиоактивного распада. Основной закон
радиоактивного распада связывает активность А с количеством N
атомов радионуклида или ядерного изомера соотношением:
А = "лямбда"N. (2)
Коэффициент пропорциональности "лямбда" называют "постоянной
радиоактивного распада". Он связан с периодом полураспада
соотношением:
In2 0,693
"лямбда" = ----- ~= ------. (3)
Т1/2 Т1/2
Активность радионуклида убывает со временем по
экспоненциальному закону:
0,693t
- ------
-"лямбда"t Т1/2
Аt = А0 е = А0 е , (4)
где At и A0 - активности в момент времени t и 0 соответственно.
Радионуклидный анализ - исследование радионуклидного состава
радиоактивного препарата с целью обнаружения и количественного
определения различных радионуклидов.
Радионуклидная чистота препарата - отношение активности
основного радионуклида к общей активности препарата, выраженное в
процентах, не является постоянной характеристикой данного
препарата, а изменяется с течением времени.
Радионуклидные примеси - примеси других радиоактивных нуклидов
(как того же, так и других элементов). Величину радионуклидных
примесей выражают в процентах к активности основного нуклида на
|
