|
Стр. 15
значениями М из II.3.6, особенно при больших значениях g. Величина
g должна быть всегда меньше единицы, в противном случае весь опыт
следует считать некорректным и нуждающимся в повторении.
Если можно предположить, что активности испытуемого и
стандартного препаратов отличаются незначительно, следует выбирать
1 0 0
дозы так, чтобы было соответственно lg D = --- (lg D1 + lg D2),
2
0 1
lg D = --- (lg D1 + lg D2) в испытаниях типа 2; 1 и 1; 2 либо
2
0 0
D1 = D1; D2 = D2 в испытании типа 2; 2 и т. д. При существенном
отличии этих активностей такой выбор доз неоптимален и от него
следует отказаться. В этом случае из значения М, полученного по
1 0 0
формуле II.3.6, следует вычесть величины lg D - - (lg D1 + lg D2),
2
0 1 0
lg D - --- (lg D1 + lg D2), lg D1 - lg D1 или др. в зависимости
2
от типа испытания. В формулы II.3.7 и II.3.8 должно войти уже
скорректированное значение М.
Пример II.4. В табл. II.3.1 приведены результаты испытания по
стандартизации образца АКТГ; эффект характеризуется концентрацией
(в мг%) аскорбиновой кислоты в надпочечнике. В данном случае мы
имеем испытание типа 2; 3. По формуле II.3.1 получаем, используя
_
значения "e " и "z " из табл. IV приложения, а значения у - из
ФИ ФИ
табл. II.3.1:
_0 0 _ _ _
Е = [(-1)у1 + 1у2 + (-2)у1 + 0у2 + 2у3] / 5 =
= (-351 + 269 - 2 х 336 + 2 х 189) / 5 = -75,2;
F = (- 3 х 351 - 3 х 269 + 2 х 336 +
+ 2 х 256 + 2 х 189) / 6 = - 49,67;
G = (2 х 351 - 2 х 269 - 336 + 189) / 2 = 8,5:
Н = 336 - 2 х 256 + 189 = 13,0.
Далее по данным из табл. II.3.1 находим:
2552 + 1660 + 1958 + 2802 + 1582
V = --------------------------------- = 70,36,
(2 + 3) х 6 x (6 - 1)
так что формулы последнего столбца табл. IV, приложения, дают
значения:
А = 5 х 70,36/6 = 58,63; B = 77,66; V = 175,90; V = 422,16.
G H
При вычислении B учтено, что I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602.
Проверка на линейность дозовой зависимости и на параллельность
прямых дает:
--- -------
H / /V = 13,0 / \/ 422,16 = 0,633;
\/ Н
--- -------
G / /V = 8,5 / \/ 175,90 = 0,641.
\/ G
Таблица II.3.1
Уровни факторов (дозы)
-----------------T-----------T-----------T-----------T-----------T-----------¬
¦ ¦ 0 ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Эффекты ¦ 0 y1, ¦ 0 y2, ¦ y1, ¦ y2, ¦ y3, ¦
¦ ¦D1 = 0,1 ЕД¦D2 = 0,4 ЕД¦D1 = 0,1 ЕД¦D2 = 0,4 ЕД¦D3 = 1,6 ЕД¦
+----------------+-----------+-----------+-----------+-----------+-----------+
¦ ¦ 370 ¦ 225 ¦ 310 ¦ 276 ¦ 187 ¦
¦ ¦ 342 ¦ 268 ¦ 356 ¦ 228 ¦ 215 ¦
¦ ¦ 335 ¦ 284 ¦ 345 ¦ 252 ¦ 200 ¦
¦ y ¦ 369 ¦ 247 ¦ 313 ¦ 273 ¦ 168 ¦
¦ ji ¦ 318 ¦ 296 ¦ 340 ¦ 279 ¦ 193 ¦
¦ _ ¦ 372 ¦ 264 ¦ 352 ¦ 228 ¦ 171 ¦
¦ y ¦ 351 ¦ 269 ¦ 336 ¦ 256 ¦ 189 ¦
¦ i ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ n _ 2¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ SUM (y - y) ¦ 2552 ¦ 1660 ¦ 1958 ¦ 2802 ¦ 1582 ¦
¦ j=1 ij ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L----------------+-----------+-----------+-----------+-----------+------------
0
Обе эти величины меньше, чем t(95%; f) = 2,060 [для f = (r + r) х
(n - 1) = 25 степеней свободы], так что можно продолжать расчет.
По формулам II.3.5 и II.3.6 получаем:
Ь = - 75,2 / 0,602 = -124,9;
M' = - 49,67 / (-124,9) = 0,3977.
Поскольку в данном испытании средние дозы стандартного и
испытуемого препаратов не совпадают, то надо из M' вычесть
величину
lg 0,l + lg 0,4 + lg l,6 lg 0,1 + lg 0,4
------------------------ - --------------- =
3 2
= - 0,3980 + 0,6990 = 0,3010,
так что
0
М = 0,3977 - 0,3010 = 0,0967; D /D = 124,9%.
Далее вычисляем по формулам II.3.9 и II.3.8:
2
77,66 х 1,960
g = ------------- = 0,0191; 1 - g = 0,9809;
2
(- 124,9)
0,0967 1,96
M = ------- +/- ------------------ x
H,B 0,9809 (- 124,9) х 0,9809
--------------------------------
x \/ 58,63 х 0,9809 + 77,66 х 0,0961 = [- 0,0235; 0,2207].
Окончательно получаем:
0
(D /D) = [94,7%; 166,2%].
H, B
Доверительные интервалы во всех этих испытаниях могут быть
сужены, если использовать в опыте сопряженные группы животных.
Например, в испытании типа 2;2 целесообразно использовать n
четверок животных, каждая из которых содержит животных из одного
помета, одинакового пола и близкой массы тела; каждая четверка
0 0
животных используется для определения четверки значений: у1; у2,
у1 и у2. При такой постановке опыта
2 2
SUM d - SUM "ДЕЛЬТА"
V = ---------------------, (II.3.11)
3n(n - 1)
2
где d - числитель формулы II.3.2, а
2 0 0 _0 _0 _ _ 2
SUM "ДЕЛЬТА" = SUM [(у1 + у2 + у1 + у2) - (у1 + у2 + у1 + у2)] .
(II.3.12)
Число степеней свободы равно f = 3(n - 1).
Доверительный интервал может быть также сужен, если методика
испытания допускает выполнение повторных определений на каждом
животном - с достаточным разрывом во времени, обеспечивающем
восстановление исходного состояния после первого опыта. В
повторном опыте те животные, на которых определялась активность
0
у , используются для определения у и наоборот. Кроме того,
животные, получившие в первом опыте меньшую дозу, получают во
втором опыте большую дозу и наоборот (метод двойного перекреста,
см. табл. II.3.2).
Таблица II.3.2
---------T------------T------------T-----------------------------¬
¦ Группа ¦ Первый ¦ Второй ¦ Разность результатов ¦
¦животных¦ опыт ¦ опыт ¦ ¦
+--------+------------+------------+-----------------------------+
¦ ¦ 0 ¦ ¦ 0 ¦
¦1 ¦ у1 ¦ у2 ¦ ДЕЛЬТА1 = у2 - у1 ¦
+--------+------------+------------+-----------------------------+
¦ ¦ 0 ¦ ¦ 0 ¦
¦2 ¦ у2 ¦ у1 ¦ ДЕЛЬТА2 = у1 - у2 ¦
+--------+------------+------------+-----------------------------+
¦ ¦ ¦ 0 ¦ 0 ¦
¦3 ¦ у1 ¦ у2 ¦ ДЕЛЬТА3 = у2 - у1 ¦
+--------+------------+------------+-----------------------------+
¦ ¦ ¦ 0 ¦ 0 ¦
¦4 ¦ у2 ¦ у1 ¦ ДЕЛЬТА4 = у1 - у2 ¦
L--------+------------+------------+------------------------------
При таком построении испытания надо пользоваться формулами:
______ ______ ______ ______
E = (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА2 + ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.13)
______ ______ ______ ______
F = (ДЕЛЬТА1 + ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.14)
______ 2 ______ 2
SUM (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА1) + SUM (ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА2)
n n
V = ------------------------------------------------------ +
8n(n - 1)
(II.3.15)
______ 2 ______ 2
SUM (ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА3) + SUM (ДЕЛЬТА4 - ДЕЛЬТА4)
n n
+ -----------------------------------------------------;
8n(n - 1)
2
А = V/2, B = V/(2I ). (II.3.16)
Дальнейшие расчеты производят по формулам II.3.5 - II.3.10,
причем t(P, f) берется из табл. II приложения для числа степеней
свободы f = 4 (n - 1).
Пример II.5. В табл. II.3.3. приведены результаты испытания
(стандартизация образца АКТГ), построенного по методу двойного
перекреста (в примере II.4 эти же данные были использованы в
умышленно рандомизированном виде, чтобы не сказывался эффект
сопряженности тест - объектов). По формулам II.3.13 - II.3.16
(получаем):
Е = (-90 - 66 - 68 - 101)/4 = -81,25;
F = (-90 + 66 + 68 - 101)/4 = -14,25;
V = (1178 + 104 + 258 + 546)/(8 х 3 х 2) = 43,46;
2
А = 43,46/2 = 21,73; В = 43,46/(2 х 0,602 ) = 59,96
(I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602);
кроме того, f = 4 х 2 = 8, t (95%, 8) = 2,306.
Теперь по формулам II.3.5-II.3.10 находим:
Ь = -81,25/0,602 = -135,0;
0
M = -14,25 / (-135,0) = 0,1056; D /D = 127,6%;
2 2
g = 59,96 х 2,306 / (-135,0) = 0,0175; 1 - g = 0,9825;
0,1056
М = ------ +/-
H,B 0,9825
--------------------------------
2,306 / 2
+/- ---------------- \/ 21,73 х 0,9825 + 59,96 х 0,1056 =
- 135,0 х 0,9825
= 0,1075 +/- 0,0816 = [0,0259; 0,01891];
0
(D /D) = [106,1%; 154,6%].
H,B
0
Доверительный интервал для D /D получился более узким, чем без
учета сопряженности тест - объектов (см. пример II.4), хотя
использовано меньше результатов испытаний.
Когда имеются результаты нескольких независимых определений
эквивалентных доз, их можно объединить с целью получения более
0
точной оценки для D /D и более узкого доверительного интервала для
этой величины. При этом пользуются приближенными формулами (точные
формулы весьма громоздки):
_
_ M
M = ------ +/- t(P, f)S , (II.3.17)
H,B 1 - g M
_
M Mj
------ = SUM (Wj -----) / SUM Wj; (II.3.18)
1 - g 1 - g
j
-------
S = 1 / \/ SUM Wj, (II.3.19)
M
2
где весовыми коэффициентами Wj, служат обратные дисперсии 1 / s :
Mj
2 2
b (1 - g )
1 j j
Wj = ---- = -------------------; (II.3.20)
2 2
s Aj(1 - g ) + BjMj
Mj j
j = 1, 2, ..., k есть номер испытания, a t(P, f) берется для числа
степеней свободы, равного сумме чисел степеней свободы отдельных
испытаний: f = SUM f . Доверительный интервал для усредненного
0 j
отношения D /D находят по формуле:
_
(D0/D) = antilg(2 + M ). (II.3.21)
H,B H,B
Законность указанного объединения (т. е. случайности различия
между отдельными М) проверяют при помощи критерия "хи - квадрат":
2 - ¬2
2 Mj ¦ Mj ¦
"хи" = SUM (Wj --------- ) - ¦SUM (Wj ------)¦ / SUM Wj (II.3.22)
2 2 ¦ 1 - g ¦
(1 - g ) L j -
j
2 2 2
должно быть "хи" < "хи" (95%, f), где "хи" (95%, f) берут из
табл. II
Таблица II.3.3
-------T---------------T---------------T------T---------------T----¬
¦Группа¦1-й день опыта ¦2-й день опыта ¦"ДЕЛЬ-¦d = "ДЕЛЬТА" - ¦ 2 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ТА" ¦ ______ ¦d ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦- "ДЕЛЬТА" ¦ ¦
+------+---------------+---------------+------+---------------+----+
¦1 ¦ 370¦ 273¦- 97 ¦- 7 ¦49 ¦
¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦y1 342¦y2 279¦- 63 ¦ 27 ¦729 ¦
¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦D1 = 0,1 ЕД 335¦D2 = 0,4 ЕД 225¦- 110 ¦- 20 ¦400 ¦
¦ ¦ ¦Сумма ¦- 270 ¦ 0 ¦1178¦
¦ ¦ ¦Среднее ¦- 90 ¦ ¦ ¦
¦2 ¦ 255¦ 313¦ 58 ¦- 8 ¦64 ¦
¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦y2 268¦y1 340¦ 72 ¦ 6 ¦36 ¦
¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦D2 = 0,4 ЕД 284¦D = 0,1 ЕД 352¦ 68 ¦ 2 ¦4 ¦
¦ ¦ ¦Сумма ¦ 198 ¦ 0 ¦104 ¦
¦ ¦ ¦Среднее ¦ 66 ¦ ¦ ¦
¦3 ¦ 310¦ 247¦- 63 ¦ 5 ¦25 ¦
¦ ¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦y1 356¦y2 296¦- 60 ¦ 8 ¦64 ¦
¦ ¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦D1 = 0,1 ЕД 345¦D2 = 0,4 ЕД 264¦- 81 ¦- 13 ¦169 ¦
¦ ¦ ¦Сумма ¦ 204 ¦ 0 ¦258 ¦
¦ ¦ ¦Среднее ¦- 68 ¦ ¦ ¦
¦4 ¦ 276¦ 369¦ 93 ¦- 8 ¦64 ¦
¦ ¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦y2 228¦y1 318¦ 90 ¦- 11 ¦121 ¦
¦ ¦ ¦ 0 ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦D2 = 0,4 ЕД 252¦D1 = 0,1 ЕД 372¦ 120 ¦ 19 ¦361 ¦
¦ ¦ ¦Сумма ¦ 303 ¦ 0 ¦546 ¦
¦ ¦ ¦Среднее ¦ 101 ¦ ¦ ¦
L------+---------------+---------------+------+---------------+-----
приложения для числа степеней свободы f = k - 1 (k - число
объединяемых испытаний). В частности, когда объединяются
результаты двух испытаний, то
- M1 M2 ¬
W1W2¦------ - ------ ¦
2 L1 - g1 1 - g2 -
"хи" = ------------------------- (II.3.23)
W1 + W2
2
при f = 1, так, что "хи" (95%, 1) = 3,84.
II.4. ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ЛАТИНСКОГО КВАДРАТА
При биологическом испытании антибиотиков методом диффузии в
агар на лотках наиболее употребительна схема латинского квадрата,
позволяющая рандомизировать неоднородность бактериальной культуры
по обоим направлениям поверхности питательной среды. Например, в
случае испытания 2; 2 дозы могут располагаться следующим образом:
0 0
D1 D2 D1 D2
0 0
D2 D1 D2 D1
(II.4.1)
0 0
D1 D2 D1 D2
0 0
D2 D1 D2 D1
Здесь каждая доза встречается по одному разу в каждой строке и
в каждом столбце. В данном случае последовательные строки получены
циклической перестановкой из предыдущих строк, но это не
единственный способ построения латинского квадрата. Например,
можно переставлять столбцы или строки (или и то, и другое) из
приведенной выше схемы по жребию. В руководствах по планированию
эксперимента можно найти и другие схемы.
Если для стандартного и испытуемого препаратов используются по
три дозы, то соответствующий латинский квадрат будет иметь шесть
строк и шесть столбцов и т.д. При двух дозах стандартного и двух
дозах испытуемого препарата можно построить латинский квадрат 8х8,
располагая дозы так, чтобы каждая встречалась по два раза в каждой
строке и в каждом столбце.
0
Введем следующие обозначения: k - число строк в квадрате; r и
r - соответственно число использованных доз стандартного и
0
испытуемого препаратов (например, при размещении четырех доз D1,
0 0
D2, D1, D2 в квадрате 8х8 будет k = 8, r = 2, r = 2, а для
0
квадрата II.4.1: k = 4, r = 2, r = 2); у - эффективность в
ij
ячейке квадрата на пересечении i-й строки и j-го столбца
(независимо от того, относится эта эффективность к стандартному
_ _
или испытуемому препарату); у = SUM у /k и у = SUM у / k -
i j ij j ij
средние эффективности соответственно для строки i и для столбца j;
2 _ _
у = SUM y /k = SUM у /k = SUM у / k
i,j i,j i i j j
- общая средняя эффективность для всего комплекса. Тогда
2 - 2 2¬
SUM d - k ¦SUM d + SUM d ¦
j,i L i i j j-
V = -----------------------------, (II.4.2)
2 0
n(k - 2k - r - r + 2)
2 - _ 2¬ - _ 2¬
где SUM d = SUM ¦SUM (у - у ) ¦ = SUM ¦SUM (у - у ) ¦,
i L j i,j i - j L i,j j -
2 _ _ 2 2 _ _ 2
SUM d = SUM (у - у ) , SUM d = SUM (у - у ) ,
i i i j j j
а n - число испытаний при каждой дозе стандартного или испытуемого
препарата. Остальные расчеты производятся по формулам предыдущего
параграфа, причем t(P, f) берутся из табл. II приложения для числа
степеней свободы f = (k -1)(k - 2).
Пример II.6. В табл. II.3.3 приведены результаты совместного
испытания стандартного и испытуемого препаратов неомицина при
дозах 100 и 200 мкг в 1 мл; активность характеризуется диаметром
зоны угнетения в миллиметрах. Использован латинский квадрат вида
(II.4.1). В этой же таблице показаны расчеты, приводящие к
2 2
величинам SUM d и SUM d , а в табл. II.4.2 показано вычисление
i i j j 2
средних дозовых эффективностей и величины SUM d .
i,j
2
Таким образом, SUM d = 14,00 + 28,75 + 5,00 + 8,75 = 56,50,
i,j
0
а так как в данном случае n = 4, k = 4, r = 2, r = 2, то по
формуле II.4.2 получаем:
56,50 - 4 x (5,125 + 2,125)
V = --------------------------- = 1,146.
4 x (16 - 8 - 2 - 2 + 2)
Данное испытание относится к типу 2;2, так что использование
соответствующего раздела табл. IV приложения вместе с формулами
II.3.4 - II.3.10 дает:
G = 219,0 - 230,75 - 221,50 + 232,75 = - 0,50;
---
V = 4 х 1,146 = 4,584; ¦G¦ / / V = 0,233 < 2,447
G \/ G
(t(95%, f) для f = (4 - 1)(4 - 2) = 6), поэтому одинаковость
наклонов двух дозовых прямых не отвергается; далее:
Е = (- 219,0 + 230,75 - 221,50 + 232,75) / 2 = 11,50;
F = (- 219,0 - 230,75 + 221,50 + 232,75) / 2 = 2,25;
2
A = V = 1,146; I = lg 200 - lg 100 = 0,301; B = V/I = 12,65;
0
b = 11,50/0,301 = 38,2; M = 2,25/38,2 = 0,0589; D /D = 114,5%;
2 2
g = 12,65 х 2,447 /38,2 = 0,052; 1 - g = 0,948;
0,0589
M = ------- +/-
H, B 0,948
--------------------------------
2,447 / 2
+/- ------------ \/ 1,146 х 0,948 + 12,65 х 0,0589 =
38,2 х 0,948
= 0,062 +/- 0,0718 = [- 0,0097; 0,1340];
0
(D /D) = 97,8%; 136,1%.
H, B
При проведении испытания по методу латинского квадрата потеря
отдельных результатов нарушает всю схему расчетов, поэтому
необходимо "заместить" их надлежащими оценками. Проще всего это
можно сделать, подставив на место выпавшего результата среднее из
оставшихся результатов для той же дозы того же препарата.
Применяемый в дисперсионном анализе более сложный способ оценки
выпавшего значения не дает в задаче определения эквивалентных доз
существенного повышения точности общих результатов испытания.
Таблица II.4.1
----------------------------------------T-------T------T-----T------¬
¦ _ ¦ ¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ Результаты испытания, у ¦SUM у ¦ у ¦ d ¦ d ¦
¦ ij ¦ j ij¦ i ¦ i ¦ i ¦
+---------------------------------------+-------+------+-----+------+
¦ 0 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦у = 222 у = 229 у1 = 222 у2 = 235 ¦ 908 ¦227,00¦1,00 ¦1,0000¦
¦ 1 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------------------+-------+------+-----+------+
¦ 0 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦у2 = 231 у = 217 у = 231 у1 = 220 ¦ 899 ¦224,75¦-1,25¦1,5625¦
¦ 1 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------------------+-------+------+-----+------+
¦ 0 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦у1 = 221 у2 = 233 у = 218 у = 228 ¦ 900 ¦225,00¦-1,00¦1,0000¦
¦ 1 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------------------+-------+------+-----+------+
¦ 0 0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦у = 235 у1 = 223 у2 = 232 у = 219 ¦ 909 ¦227,25¦1,25 ¦1,5625¦
¦ 2 1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------------------+-------+------+-----+------+
¦ ¦ 2 ¦
¦SUM у 909 902 903 902 ¦ 3616 SUM d = 5,12 ¦
¦ i i,j ¦ i i ¦
¦ ¦ _ ¦
¦у 227,25 225,50 225,75 225,50¦ у = 226,00 ¦
¦ j ¦ ¦
¦d 1,25 - 0,50 - 0,25 - 0,50¦ ¦
¦ j ¦ ¦
¦ 2 ¦ 2 ¦
¦d 1,5625 0,2500 0,0625 0,2500¦ SUM d = 2,125 ¦
¦ j ¦ j j ¦
L---------------------------------------+----------------------------
Таблица II.4.2
--------T------T---T--T------T------T-------T------T-----T----T------T------T------¬
¦ ¦ 0 ¦ ¦ 2¦ 0 ¦ ¦ 2 ¦ ¦ ¦ 2 ¦ ¦ ¦ 2 ¦
¦ ¦ y ¦ d ¦d ¦ y ¦ d ¦ d ¦ y1 ¦ d ¦ d ¦ y ¦ d ¦ d ¦
¦ ¦ 1 ¦ ¦ ¦ 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 2 ¦ ¦ ¦
+-------+------+---+--+------+------+-------+------+-----+----+------+------+------+
¦ ¦ 222 ¦ 3 ¦9 ¦ 229 ¦- 1,75¦ 3,0625¦ 222 ¦ 0,5 ¦0,25¦ 235 ¦ 2,25 ¦5,0625¦
¦ ¦ 217 ¦- 2¦4 ¦ 231 ¦ 0,25¦ 0,0625¦ 220 ¦- 1,5¦2,25¦ 231 ¦- 1,75¦3,0626¦
¦ ¦ 218 ¦- 1¦1 ¦ 228 ¦- 2,75¦ 7,5625¦ 221 ¦- 0,5¦0,25¦ 233 ¦ 0,25 ¦0,0625¦
¦ ¦ 219 ¦ 0 ¦0 ¦ 235 ¦ 4,25¦18,0625¦ 233 ¦ 1,5 ¦2,25¦ 232 ¦- 0,75¦0,5625¦
+-------+------+---+--+------+------+-------+------+-----+----+------+------+------+
¦Сумма ¦ 876 ¦ 0 ¦14¦ 923 ¦ 0 ¦ 28,75 ¦ 886 ¦ 0 ¦ 5 ¦ 931 ¦ 0 ¦ 8,75 ¦
¦Среднее¦219,00¦ ¦ ¦230,75¦ ¦ ¦221,50¦ ¦ ¦232,75¦ ¦ ¦
L-------+------+---+--+------+------+-------+------+-----+----+------+------+-------
II.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ
ДИФФУЗИИ В АГАР НА ЧАШКАХ ПЕТРИ
Описанная в предыдущем параграфе методика определения
активности антибиотиков по схеме латинского квадрата предполагает
использование лотков. Возможен и другой способ определения этой
активности - по диффузии в агар на чашках Петри. Ниже описан
трехдозный вариант этого метода <*>.
--------------------------------
<*> Этот раздел основан на разработке Всесоюзного НИИ
антибиотиков и Государственного НИИ по стандартизации и контролю
лекарственных средств Министерства здравоохранения СССР.
Стандартный (S) и испытуемый (U) образцы растворяют из расчета
1 мг в 1 мл (основной раствор), затем готовят по три концентрации
S S S
рабочих растворов стандарта (D1, D2, D3) и испытуемого образца
U U U
(D1, D2, D3), относящиеся друг к другу как 1:2:4. Все 6
растворов закапывают на одну чашку Петри, причем
последовательность внесения растворов в цилиндры или в лунки
должна быть случайной (возможные последовательности внесения
растворов приведены в табл. II.5.1). Число чашек n должно быть не
меньше 6.
Для уменьшения влияния колебаний во времени между внесением
различных растворов рекомендуется после внесения растворов
выдерживать чашки в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После
S U
измерения зон угнетения роста результаты опыта у , и у
i,j i,j
(i = 1, 2, 3 - номера доз, j = 1, 2, ..., n - номера чашек)
записывают в таблицу (как показано в приведенном ниже численном
примере). Там же записывают получаемые расчетом следующие
вспомогательные величины:
S U
Si = SUM у и Ui = SUM у (II.5.1)
j i,j j i,j
- суммы по чашкам для каждой дозы стандарта и испытуемого образца;
S U
Tj = SUM у + SUM у , (II.5.2)
i i,j i i,j
- суммы по всем дозам для каждой чашки;
у = SUM у = (S1 + S2 + S3) +(U1 + U2 + U3) = SUM Tj (II.5.3)
i,j i,j j
- суммы всех диаметров зон задержки роста по всем дозам и чашкам.
Далее вычисляют:
S = S1 + S2 + S3 и U = U1 + U2 + U3 (II.5.4)
- суммы всех диаметров зон задержки роста отдельно для стандарта и
для испытуемого образца;
L = S3 - S1 и L = U3 - U1 (II.5.5)
S U
- "линейные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца;
Q = S1 - 2S2 + S3 и Q = U1 - 2U2 + U3 (II.5.6)
S U
"квадратичные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца.
Для проверки законности дальнейших расчетов следует провести
дисперсионный анализ результатов опыта в соответствии с табл.
II.5.2, а именно должно получиться F < F(95%; f, fост) для строк
2, 3, 4 и F > F (95%) для строки 1.
Выполнение первого условия одновременно означает, что вариации
в этих строках 2, 3, 4 должны рассматриваться как случайные, и
поэтому их следует включить в остаточную вариацию, произведя также
перерасчет значимости линейной регрессии (кстати, это относится и
к вариациям в строках 5 и 6, если они окажутся незначимыми).
Разумеется, при указанном перерасчете степени свободы вариаций,
включаемых в остаточную вариацию, должны прибавляться к числу
степеней свободы последней (fост).
Таблица II.5.1
Расположение растворов стандарта и испытуемого образца
при трехдозном варианте метода диффузии в агар
------T--------------------------T-----T--------------------------¬
¦Номер¦Порядок внесения растворов¦Номер¦Порядок внесения растворов¦
¦чашек¦ в цилиндры ¦чашек¦ в цилиндры ¦
¦ +---T---T---T----T----T----+-----+----T----T---T---T---T----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ S¦ U ¦
¦1 ¦D1 ¦D2 ¦D2 ¦D3 ¦D1 ¦D2 ¦ 17 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D1 ¦ D3¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U¦ U ¦
¦2 ¦D1 ¦D2 ¦D1 ¦D3 ¦D3 ¦D2 ¦ 18 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦ D3¦ D1 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U¦ U ¦
¦3 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦D1 ¦ 19 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦ D1¦ D3 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U¦ S ¦
¦4 ¦D1 ¦D2 ¦D1 ¦D3 ¦D3 ¦D2 ¦ 20 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D3 ¦ D1¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U¦ S ¦
¦5 ¦D1 ¦D2 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D3 ¦ 21 ¦ D1 ¦D2 ¦D1 ¦D3 ¦ D3¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U¦ S ¦
¦6 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦ 22 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦ D1¦ D3 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U¦ S ¦
¦7 ¦D1 ¦D3 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦ 23 ¦ D1 ¦D2 ¦D1 ¦D2 ¦ D3¦ D3 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U¦ S ¦
¦8 ¦D1 ¦D3 ¦D3 ¦D2 ¦D1 ¦D2 ¦ 24 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D3 ¦ D1¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U¦ S ¦
¦9 ¦D1 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦D1 ¦ 25 ¦ D1 ¦D2 ¦D3 ¦D1 ¦ D3¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ S¦ U ¦
¦10 ¦D1 ¦D3 ¦D2 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦ 26 ¦ D1 ¦D3 ¦D1 ¦D2 ¦ D3¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U¦ U ¦
¦11 ¦D1 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦ 27 ¦ D1 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦ D2¦ D1 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U¦ U ¦
¦12 ¦D1 ¦D1 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦D3 ¦ 28 ¦ D1 ¦D3 ¦D3 ¦D2 ¦ D1¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ U¦ S ¦
¦13 ¦D1 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦ 29 ¦ D1 ¦D3 ¦D1 ¦D3 ¦ D2¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U¦ S ¦
¦14 ¦D1 ¦D1 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦ 30 ¦ D1 ¦D3 ¦D3 ¦D2 ¦ D1¦ D2 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ ¦ S ¦ U ¦ S ¦ U ¦ U¦ S ¦
¦15 ¦D1 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦ 31 ¦ D2 ¦D3 ¦D2 ¦D1 ¦ D2¦ D3 ¦
+-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----+
¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ S ¦ U ¦ ¦ S ¦ U ¦ U ¦ S ¦ S¦ U ¦
¦16 ¦D1 ¦D2 ¦D3 ¦D2 ¦D3 ¦D1 ¦ 32 ¦ D1 ¦D3 ¦D1 ¦D2 ¦ D3¦ D2 ¦
L-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+-----
Если дисперсионный анализ дал нужный результат (т.е.
выполняются указанные выше условия), то вычисляется логарифм
отношения активностей испытуемого образца и стандарта по формуле:
А
U 4 U - S
M = lg ---- = --- I ---------, (II.5.7)
A 3 L + L
S U S
где A и A - активности, соответствующие рабочим растворам, а I -
U S
логарифм знаменателя прогрессии разведения (в данном случае I =
lg 2 = 0,301). Тогда отношение активностей равно:
R = antilg M (II.5.8)
Чтобы найти отношение активностей основных растворов
а /а , надо умножить величину R на коэффициент, учитывающий
U S
соответствующие (например, максимальные) степени разведения
основных растворов стандарта и образца ("гамма " и "гамма ").
S U
Тогда имеем:
"гамма "
U
а = а R --------. (II.5.9)
U S "гамма "
S
Границы 95%-ного доверительного интервала для логарифма
отношения активностей вычисляются по формуле:
--------------------
/ 2 8 2
M = CM +/- \/(С - 1)(CM + --- I ), (II.5.10)
H, B 3
где
2 2
C = L / (L - t Sост ), (II.5.11)
2
причем L и Sост берутся из табл. II.5.2, а t - есть значение
критерия Стьюдента для Р = 95% и fост числа степеней свободы
2
величины Sост. Границы доверительного интервала для отношения
активностей (R и R ) будут антилогарифмами величин М и M, а для
H B H B
доверительных границ активности образца надо вводить коэффициент
"гамма " / "гамма " в соответствии с формулой II.5.9.
U S
Пример. II.8. Активность стандарта - 950 ЕД/мг. Основной
раствор стандарта готовят из расчета 1 мг/мл, так что a = 950
S
ЕД/мл. Учитывая, что контрольная концентрация для данного
S
антибиотика равна 1 ЕД/мл, готовят рабочие растворы стандарта D1,
S S
D2 и D3 путем разведения основного раствора в 500, 1000 и 2000
раз. Полагая, что активность испытуемого образца близка к
активности стандарта, и учитывая, что рабочие концентрации для
U U U
образца D1, D2, D3, должны быть близки к рабочим концентрациям
S S S
стандарта D1, D2, D3, основной раствор образца разводят также в
500, 1000 и 2000 раз. Количество чашек n = 6.
Результаты опыта записаны в табл. II.5.3. Там же записаны
значения Si, Ui, Tj и у, вычисленные по формулам II.5.1 - II.5.3.
По этим значениям, пользуясь формулами II.5.4 - II.5.6, получаем:
S = 3310; L = 325; Q = - 5;
S S
U = 3325: L = 345; Q = -5.
U U
Дисперсионный анализ результатов опыта представлен
в табл.II.5.4, из которой видно, что условия незначимости вариаций
|
