Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 октября 2003 года
Дата введения -
1 декабря 2003 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМА PENICILLIUM CANESCENS F-832 ВКПМ - ПРОДУЦЕНТА
КСИЛАНАЗЫ В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1774-03
1. Разработаны Российским государственным медицинским
университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения
Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 ВКПМ -
продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в
диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента ксиланазы
Микроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом
фермента ксиланазы. Культура образует цепочки спор, обычно прямые
с гладкой оболочкой. Штамм растет на различных агаризованных и
жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30
-С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с
кремовым или сероватым налетом, диаметром 2 - 3 мм. На 4 - 5 сутки
инкубации размеры колонии достигают 5 - 7 мм, конфигурация и
складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий
со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний
оранжево-коричневая.
Штамм устойчив практически ко всем широко известным
антибиотикам.
ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл./куб. м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток
продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в
диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента
ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчете
выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента
основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность
плотной питательной селективной среды и подсчете выросших колоний
по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма,
как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной
целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений,
вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики: группы пенициллина,
тетрациклина, цефалоспорина и др.,
нистатин или амфотерицин.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Среда для штамма-продуцента:
агаризованное пивное сусло 5 - 6 -Б
для штамма-продуцента (агар - 1,8%,
рН 5,9 - 6,1, режим стерилизации
1,1 - 1,2 атм. в течение 30 мин.)
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Селективная среда для штамма-продуцента,
состав среды: КН РО - 1 г; МgSО 7Н О - 0,5 г;
2 4 4 2
(NН ) SО - 0,7 г; целлюлоза порошковая
4 2 4
в пересчете на сухое вещество - 0,9 г;
лактоза - 0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г;
агар - 18 г; вода дистиллированная - до 1000 мл
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают
следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по
ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и
личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном
шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших
соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5
-С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента ксиланазы воздух аспирируют при
помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее
крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой
недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим
признакам колоний, выросших на 3 - 5 сутки после посева воздуха.
Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний
продуцента.
Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор
одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для
подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина (10
мкг/мл для подавления грибковой флоры), тщательно перемешивают и
разливают по 10 - 15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной
поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на
сутки при температуре 37 -С, после чего проросшие чашки бракуют,
стерильные чашки используют для контроля воздуха.
При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную
среду расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют 50 мг/л
бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида,
тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки
Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый
предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для
ограничения разрастания колоний на чашках.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на
30 -С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний
продуцента. При необходимости культуру подвергают
микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма
Penicillium canescens F-832 ВКПМ - продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Дата проведения анализа __________________________________
Место отбора пробы _______________________________________
Название лаборатории _____________________________________
Юридический адрес организации ____________________________
Результаты микробиологического анализа
------------------T--------------------T-------------------------¬
¦Шифр или N пробы ¦ Определяемый ¦ Концентрация, кл./куб. м¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ ¦
+-----------------+--------------------+-------------------------+
L-----------------+--------------------+--------------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД
52.04.186-96. М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
3. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие
требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во
стандартов, 1981. 3 с.
|