Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-1 - ПРОДУЦЕНТА
БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1070-01
1. Разработаны к.м.н. В.И. Бобровым (ВНЦ по безопасности
биологически активных веществ).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма - Trichoderma longibrachiatum TW-1 -
продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики
выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента бета-глюканазы
Продуцент бета-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1
относится к классу несовершенных грибов. Рост характерных колоний
определяется на 5 - 6 сутки. На агаризованной среде СМ
микроорганизм образует характерные колонии до 15 мм в диаметре с
гладкой подошвой, не врастающие в агар, с волнистым краем,
пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами белого и
желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно
ветвистые. Оптимальная температура роста 28 - 30 -С.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны
- 5000 кл./куб. м, 3 класс опасности, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на
аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия)
продуцента бета-глюканазы на поверхность плотной питательной среды
СМ и подсчете выросших колоний по зонам просветления, образующихся
вокруг каждой колонии штамма как результат продукции
бета-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства,
материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791 77
Термостаты электрические суховоздушные или
водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.
5.2. Реактивы, растворы
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента
бета-глюканазы
Состав среды: KH PO - 1 г; MgSO х 7Н О -
2 4 4 2
0,5 г; (NH ) SO - 5 г; целлюлоза порошковая в
4 2 4
пересчете на сухое вещество - 5 г; глюкоза -
5 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 20 г;
вода дистиллированная - до 1000 мл.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
- требования, изложенные в руководстве "Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической
промышленности" (1980);
- положения "Инструкций по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности"
(1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу
при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются
лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области
микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу
проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5)
-С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха
не более 80%.
9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента бета-глюканазы воздух аспирируют
при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента, а прямой
метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно
протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и
внутреннюю стенку крышки.
На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со
средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают.
Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.
После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор
открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от
данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку
контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества колоний, выросших на 2 - 3
сутки после посева проб воздуха, по зонам просветления, которые
являются результатом образования целлюлаз на срезах с окрашенной
целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы.
Существенным признаком промышленных мутантов рода Trichoderma
является пониженная катаболическая репрессия по сравнению с дикими
мутантами Trichoderma. В то время как у диких штаммов глюкоза в
концентрациях выше 0,02 г/л практически полностью подавляет
образование целлюлаз в глубинной культуре, у промышленных мутантов
подавление образования целлюлаз начинается при концентрациях
глюкозы выше 1 г/л.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 -С, добавляют 50
мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл
диметил-сульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в
стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский
розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и
для ограничения разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей
средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 -С, после
чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для
контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при
28 - 30 -С на 2 дня и затем при температуре 44 -С на 18 ч для
образования вокруг колоний зон просветления.
Количественный учет микробных клеток штамма-продуцента
бета-глюканазы проводится методом подсчета зон просветления,
образующихся вокруг колоний микроорганизма как результат продукции
глюканазы на среде СМ с окрашенной целлюлозой.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м
воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме:
Протокол N ___
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Trichoderma longibrachiatum TW-1
в воздухе рабочей зоны
Дата проведения анализа ______________________________________
Место отбора пробы ___________________________________________
Название лаборатории _________________________________________
Юридический адрес организации ________________________________
Результаты микробиологического анализа
-------------------T--------------------T------------------------¬
¦ Шифр или N пробы ¦ Определяемый ¦Концентрация, кл./куб. м¦
¦ ¦ микроорганизм ¦ ¦
+------------------+--------------------+------------------------+
L------------------+--------------------+-------------------------
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной
гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий
микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
|